开发人造抗病毒免疫样系统
新型广谱抗病毒免疫样ALICE系统（图片由研究团队提供）随着全球气候变暖，未来全球将面临更多新发或再发病毒引发的传染病疫情。此前的埃博拉病毒、甲型H1N1流感、寨卡病毒、以及最近的新冠病毒肺炎（COVID-19）疫情，都对全球的经济、公共卫生安全、以及人类健康，产生了巨大冲击。除此类突发病毒外，长期潜伏于机体的病毒，如人类免疫缺陷病毒（HIV）、乙型肝炎病毒（HBV）、人乳头瘤病毒（HPV）以及单纯疱疹病毒1型（HSV-1）等，也因其高传染性和反复发作的特点，较难防治。因此，迫切需要建立针对病毒感染的广谱性抗病毒新策略。但是现有的病毒检测和清除策略均分开独立进行，尚未有集病毒检测和清除为一体的工程化系统。这促使我们设计开发针对病毒的闭环式基因线路，实现体内病毒检测清除一体化、自动化和智能化。
2022年12月9日，Nature Communications刊登了华东师范大学叶海峰研究员团队和杜克-新加坡国立大学医学院王林发院士团队，历时8年在抗病毒免疫领域的最新研究成果Engineering antiviral immune-like systems for autonomous virus detection and inhibition in mice。研究团队设计了一组集病毒检测清除于一体的闭环式免疫样系统ALICE。该系统成功模拟了人体的抗病毒免疫系统，能够自动感应和破坏入侵的病毒（图 1）。该系统以感知外源核酸的STING蛋白为接头，连接人工搭建的信号反应网络，同步输出多重抗病毒功能模块（包含抗病毒细胞因子IFN-α和IFN-β、降解病毒核酸的CRISPR-Cas9、抗病毒中和抗体）。当病毒入侵时，ALICE系统能够自动感知，并同步输出抗病毒功能蛋白，发挥抗病毒效果。
图1 ALICE系统简介
1. 自动感应病毒入侵的ALICEsen传感器
研究团队首先设计构建了ALICEsen传感器，用于测试系统感知病毒的广谱性。通过对ALICEsen传感器中的接头蛋白STING、信号级联传递的操纵子序列/启动子序列进行优化，最终成功实现STING-依赖的七类病毒的广谱性响应。研究团队后续选取HSV-1作为模式病毒，对系统的动力学特征进行探究，发现ALICEsen传感器具有很好的病毒剂量依赖、病毒感染时间依赖以及在不同细胞系中有良好的普适性。
2. 设计构建自动感应和清除病毒的ALICEim系统
研究团队在ALICEsen传感器的基础上，将输出模块中的报告基因替换为具有抗病毒功效的IFN-α和IFN-β，组装自动感应和清除病毒的ALICEim系统。实验结果显示，ALICEim系统一旦发现病毒入侵，立即启动IFN-α或IFN-β的表达，快速清除病毒。ALICEim系统成功模拟了人体的第一道免疫防线——固有免疫系统的抗病毒效果。
3. 设计构建自动感应和降解病毒基因组的ALICECas9系统
为了进一步清除潜伏在人体细胞中的病毒基因组，研究团队又开发了自动感应和降解病毒基因组的ALICECas9系统（图3）。实验结果显示，该系统中Cas9蛋白只有在病毒存在的情况下才会表达，因此形成闭环式基因线路，成功避免了Cas9蛋白持续性表达引起的细胞消耗、脱靶、耐药毒株等诸多安全性问题。同时，研究团队通过串联多重sgRNA，成功实现了腺病毒（ADV）和HSV-1的多病毒同时清除。已有研究显示，CRISPR基因编辑技术在短时间内抑制病毒复制，将会促使病毒处于潜伏状态；一旦核酸酶耗尽，极易造成病毒再度复发。因此，ALICECas9系统成功实现了感应病毒的核酸酶自动输出，将进一步推动CRISPR基因编辑技术在抗病毒领域中的应用。
图2 ALICECas9系统。
4. 设计构建自动感应和的抑制病毒的ALICEAb系统
中和抗体具有良好的病毒抑制效果，但是生产成本高、制备周期长。研究团队开发了自动感应和抑制病毒的ALICEAb系统，成功组装了低成本、调控表达、具有抗病毒功能的中和抗体细胞药物工厂。
5. 设计构建自动感应双重输出抗病毒的ALICECas9+Ab系统
在上述的研究基础上，研究团队建立了响应强度和抑制能力更强大的ALICECas9+Ab系统（图3），从病毒入侵和复制两个角度出发，协同发挥抗病毒效果。研究团队将ALICECas9+Ab基因线路上载至底盘细胞HEK-293T的基因组中，成功筛选出一株抗病毒效果最佳的细胞株HEKALICE-Cas9-E317Ab。实验结果显示，HEKALICE-Cas9-E317Ab细胞株，具有和高浓度抗HSV-1药物阿昔洛韦（ACV）相当的病毒抑制效果，可避免ACV长期使用引发耐药毒株的出现。
图3 ALICECas9+Ab系统。
6. 动物模型体内测试ALICE系统的抗病毒效果
随后，研究团队将ALICE系统上载至底盘细胞中，并由水凝胶包裹移植到小鼠体内。实验结果显示：无论在病毒感染发生的前、中、后期，ALICE系统均能自动感知和抑制病毒。尤其令人兴奋的是，ALICE系统携带的中和抗体输出模块，可在病毒感染后的六小时自动输出，比人体适应性免疫系统产生中和抗体至少提早了一周。为了进一步探索ALICE系统的临床应用前景，研究团队选取由单纯疱疹病毒1型（HSV-1）感染引发的疱疹性角膜炎（HSK）小鼠模型，由腺相关病毒（AAV）载体递送ALICE系统至小鼠的眼角膜。实验结果显示：ALICE系统能够成功抑制小鼠角膜、三叉神经节以及大脑中的病毒载量；并且面对病毒的迭代感染，也能发挥良好的抗病毒效果。目前，临床上治疗HSV-1的常用方法是抗病毒药物，如阿昔洛韦（ACV）等核苷类似物，这类药物靶点单一，极易造成耐药毒株的出现。ALICE系统的出现无疑是给抗病毒治疗领域，提供了一种灵活、创新、模块化的抗病毒治疗新策略。总而言之，模块化设计的闭环式ALICE系统，拥有可更换的检测模块、灵活布线的内源信号网络、多重的输出模块，经由不同的底盘细胞或AAV载体递送，能够灵活应用于特定的病原体防控需求（选择合适的控制元件）。ALICE技术平台作为人造抗病毒免疫系统，可诱导干扰素表达释放发挥非特异性抗病毒免疫功能，或诱导中和抗体等发挥适应性免疫防御，增强机体的免疫防御体系。研究团队认为，本研究中的各类ALICE系统可作为示例模型，未来很容易适应特定免疫样细胞的设计开发，实现以哺乳动物为目标的潜在病原体的智能感应和清除。据悉，华东师范大学叶海峰研究员和杜克-新加坡国立大学医学院王林发院士为该研究论文的共同通讯作者，华东师范大学博士后王义丹为该研究论文的第一作者。原文链接：https://www.nature.com/articles/s41467-022-35425-9
来源：BioArtMED
